耦合末端盐桥与定点突变的重组腈水合酶催化动力学

陈杰; 贾旭; 于慧敏; 罗晖; 沈忠耀

doi:10.3969/j.issn.0438-1157.2014.07.044

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耦合末端盐桥与定点突变的重组腈水合酶催化动力学

生物化学工程与技术 | 更新时间：2025-12-10

- 耦合末端盐桥与定点突变的重组腈水合酶催化动力学
- Catalytic kinetics of recombinant nitrile hydratase coupling terminal salt bridge and point-mutation
- 化工学报 2014年第7期页码：2821-2828
- 作者机构：
  
  1. 清华大学化学工程系生物化工研究所,北京,100084
  2. 北京科技大学生物科学与技术系,北京,100083
- 作者简介：
- 基金信息：
- DOI：10.3969/j.issn.0438-1157.2014.07.044
  中图分类号： 814.9
- 网络首发：2014-07-05，
  
  纸质出版：2014-07-05
- 稿件说明：
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陈杰, 贾旭, 于慧敏, 等. 耦合末端盐桥与定点突变的重组腈水合酶催化动力学[J]. 化工学报, 2014,(7):2821-2828.

CHEN Jie, JIA Xu, YU Huimin, et al. Catalytic kinetics of recombinant nitrile hydratase coupling terminal salt bridge and point-mutation[J]. CIESC Journal, 2014, (7): 2821-2828.
陈杰, 贾旭, 于慧敏, 等. 耦合末端盐桥与定点突变的重组腈水合酶催化动力学[J]. 化工学报, 2014,(7):2821-2828. DOI： 10.3969/j.issn.0438-1157.2014.07.044.

CHEN Jie, JIA Xu, YU Huimin, et al. Catalytic kinetics of recombinant nitrile hydratase coupling terminal salt bridge and point-mutation[J]. CIESC Journal, 2014, (7): 2821-2828. DOI： 10.3969/j.issn.0438-1157.2014.07.044.

摘要

双亚基腈水合酶是催化丙烯腈水合生产丙烯酰胺的重要工业酶。通过Discovery Studio 2.5软件对C-末端盐桥耦合定点突变改造的耐热型基因重组腈水合酶NHaseM-TH-SBM（S344K-S346K-L347E-N362S-435DT436（+））进行盐桥网络分析，发现其全局盐桥总数有所下降，但双亚基界面间盐桥数量提高到7个。在重组大肠杆菌中表达了原腈水合酶NHaseM-TH（TH）、盐桥突变酶NHaseM-TH-SB（SB）和盐桥耦合定点突变的重组酶NHaseM-TH-SBM（SBM），研究了3种酶的催化反应动力学和失活动力学。结果表明，SBM的腈水合酶活性为543.9 U·mg-1，比TH提高了31.0%；其米氏方程催化速率常数Kcat比TH提高了20%。SBM的表观失活常数KD在25～42℃范围内均明显低于对照TH，在42℃时为TH的68.0%，显示了良好的热稳定性。SBM是活性和稳定性同时提高的重组腈水合酶。

Abstract

Nitrile hydratase (NHase) is a double-subunit enzyme widely used for industrial production of acrylamide from acrylonitrile. By Discovery Studio 2.5

salt-bridge network simulation toward different recombinant NHases was carried out. A new mutant

NHaseM-TH-SBM (SBM)

was obtained

which couples the salt-bridge mutation in C-terminal (SB

S344K-S346K-L347E-435DT436(+)) with the point-mutation of N362S. Simulation results show that the total number of salt-bridges in SBM decreases but the number in a-b interface increases to 7 pairs. Using both the original NHase TH and SB mutant as controls

SBM is successfully expressed in recombinant E. coli. The activity is 543.9 U·mg-1

increased by 31.0% with respect to TH. The reaction and inactivation kinetics was also investigated. The catalytic rate constant Kcat of Michaelis-Menten equation is increased by 20% and 60% compared to TH and SB

respectively. The apparent inactivation constant KD is 68.0% of TH at 42℃

indicating that SBM also improves thermal stability.

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